Владивостокский Государственный Медицинский Университет

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

РЕФЕРАТ: "Диагностика стафилококковых инфекций"

Выполнил: Новак А.Л., 301 гр., л/ф, Владивосток, 1998.

Предисловие

Несмотря на то, что стафилококки принадлежат к числу наиболее легко обнаруживаемых и распознаваемых микроорганизмов, не требующих сложных диагностических приемов для их выявления, в практической работе микробиологи до сих пор испытывают определенные трудности при установлении их причинной роли в ряде различных заболеваний. С одной стороны, присутствие патогенных стафилококков, обнаруживаемое в исследуемом материале, не всегда является убедительным доказательством их этиологического значения. С другой, учитывая большое разнообразие проявлений биологической активности этих микробов, зависящее от разных, не всегда поддающихся учету факторов, широкую их изменчивость под влиянием лекарственных веществ и самого макроорганизма, довольно сложно бывает определить их потенциальную патогенность. Наконец, третья причина связана с тем, что стафилококки являются представителями нормальной микрофлоры из группы условно патогенных микроорганизмов и, наряду с непатогенными, патогенные представители обитают в организме людей, распространяясь при этом весьма неравномерно на разные участки человеческого тела.

Если выделение патогенного стафилококка, из крови больных людей и различных полостей, которые принято считать стерильными, в подавляющем большинстве случаев может служить доказательством его роли как возбудителя болезни, то присутствие стафилококков на слизистых зева, носа и т. д. даже при явном болезненном состоянии их требует большой осторожности исследователя в выводах об этиологии данных заболеваний.

Поэтому, естественно, не может быть общих рекомендаций, как при диагностике различных стафилококковых инфекций, так и при микробиологических исследованиях участков тела человека и разных объектов внешней среды. Широкий обмен мнениями между микробиологами научных учреждений и практических лабораторий, осуществляемый на съездах и конференциях, посвященных проблемам стафилококковых инфекций, а также при личных контактах, казалось бы, должен был привести к определенным взглядам на различные методы исследования, предлагаемые для выделения и идентификации стафилококков. Однако большое число запросов, поступающих из лабораторий СЭС и лечебных учреждений, свидетельствует о явных затруднениях, которые возникают у исследователей при решении разных вопросов микробиологической диагностики стафилококков, а в ряде микробиологических учреждений бытуют еще некоторые устаревшие методы и приемы, приводящие к неправильным оценкам и даже досадным недоразумениям.

Важным условием эффективности лабораторной диагностики является сочетанное определение качественных и количественных критериев содержания патогенных стафилококков в исследуемом материале. Исходя из этого, я считаю необходимым изложить ряд методов основных микробиологических исследований, наиболее простых и доступных для каждой практической и научной лаборатории, которыми мы пользуемся в течение многих лет.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ

Предварительная диагностика стафилококков может основываться на бактериоскопическом изучении препаратов - мазков, окрашенных по Граму. Патогенные стафилококки, помимо гроздевидного расположения, характеризуются правильной сферической формой клеток. Обнаружение стафилококков, находящихся внутри клеток, позволяет дать ответ о наличии стафилококковой инфекции. В большинстве же случаев для точного установления патогенности обнаруженных стафилококков требуется выделить эти микроорганизмы в чистой культуре путем посева исследуемого материала на плотные питательные среды.

В настоящее время ассортимент дифференциальных, элективных и накопительных сред, предложенных для выделения патогенных стафилококков, весьма значителен и продолжает расширяться. Многие исследователи на основе знания основных биохимических характеристик и питательных потребностей патогенных стафилококков при конструировании сред стремятся повысить их высеваемость и обеспечить возможность осуществлять их количественный учет, получить надежный способ отличать потенциально болезнетворные стафилококки от сапрофитов.

Употребление жидких накопительных сред для первичного выделения стафилококков нецелесообразно, так как лишает исследователя возможности количественной оценки содержания микробов в обследуемых объектах, а при случайных загрязнениях способствует ошибкам. Особенно это относится к таким исследованиям, как обнаружение носительства патогенных стафилококков, где доказательством является лишь массивный рост, либо определение этиологической роли этих микроорганизмов "при пищевых отравлениях или наружных воспалительных процессах. Если же речь идет об исследовании крови, а также о тех немногих случаях, когда бывает необходимо выявить даже единичные жизнеспособные особи этих микробов, например при контроле эффективности дезинфекции, проверке на стерильность или титрационных посевах, то в подобных случаях использование накопительных сред вполне оправдано.

Из большого числа разнообразных питательных сред, опробованных для первичного выделения стафилококков, в практике оправдал,;1' себя немногие. Обычный питательный агар (рН 7,2 7,4), приготовленный путем добавления 2% агар-агара к мясопептонному бульону или к триптическому перевару Хоттингера, может быть использован при исследовании экссудатов из закрытых полостей. Стафилококки вырастают через 18-24 ч инкубации при 37° С в виде гладких блестящих с ровными краями непрозрачных и слегка выпуклых колоний. Характер пигмента выявляется лучше после дополнительного суточного выдерживания чашек при комнатной температуре (20° С) на свету. Если в исследуемом материале присутствует посторонняя флора, то по внешнему виду колонии стафилококков могут быть трудно отличимы.

Употребление кровяного агара дает возможность, кроме выявления пигмента, определить и гемолитическую активность стафилококков. При этом необходимо помнить, что гемолитическая способность, определяемая на чашках с кровяным агаром, зависит от многих факторов - вида крови, ее концентрации, наличия в ней антитоксинов, толщины слоя среды, содержания углекислого газа в атмосфере культивирования, густоты посева, присутствия и характера сопутствующей флоры и т. д.

При отборе колоний с кровяного агара необходимо отвивать как гемолитические, так и не дающие гемолиза, особенно если исследование проводится на среде с человеческой или лошадиной кровью, а отсутствие гемолиза на таких средах не позволяет заключить об отсутствии вообще гемолитической активности. Поэтому использование кровяного агара для первичного посева целесообразно только при обследовании объектов, не содержащих посторонней микрофлоры, и желательно добавлять в питательную среду кровь кролика или барана.

Если же проводится исследование гноя открытых ран или отделяемого язв или свищей, то следует пользоваться элективно-дифференциальной средой для стафилококков - желточно-солевым агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича. Элективность этой среды обеспечивается высоким содержанием хлористого натрия, а добавленный яичный желток позволяет выявлять лецитовителлазную активность, которая является одним из показателей патогенности стафилококков и в силу этого ЖСА более четко дифференцирует патогенных представителей, чем кровяной агар. Приготовление ЖСА несложно.

Заготовляют впрок и стерилизуют в автоклаве при 120 °С" в течение 20 мин питательный агар (МПА или Хоттингера) рН 7,2-7,4, содержащий 10% поваренной соли. Перед употреблением солевой питательный агар растапливают, остужают до 45-50 °С и добавляют к нему 20% по объему стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл физиологического раствора). Для лучшего эмульсирования желательно иметь колбы со стеклянными бусами. После тщательного перемешивания среду разливают по 20-25 мл в чашки, которые могут храниться в холодильнике в течение нескольких дней.

Следует производить массивный посев исследуемого материала на чашки с ЖСА, а инкубацию вести в течение 2 суток при 35-37° С. Посторонняя флора резко подавляется, стафилококки же на ЖСА вырастают практически в чистой культуре. Непосредственно при просмотре чашек вокруг колоний отмечается образование радужных венчиков и мутной зоны - лецитовителлазная реакция. Такие колонии, не менее двух из каждого посева, отвивают на скошенный мясо-пептонный агар для последующей проверки выросших культур в реакции плазмо-коагуляции.

Чтобы избежать ошибок в определении желточной реакции, необходимо иметь в виду, что иногда наблюдается помутнение среды без радужного ободка, в этом случае проба на лецитовителлазу считается отрицательной. Если же колонии, выросшие на ЖСА, не дают лецитовителлазной реакции, т. е. не окружены радужным венчиком, но имеется рост стафилококков, то их тоже считают подозрительными и также отвивают не менее двух из каждого такого посева на чашки с простым питательным агаром пятнами диаметром 5-10 мм. После суточного инкубирования при 37° С полученные макроколонии проверяют в реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешивают петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1 :4. Образование хлопьев учитывают в течение 30с-1 мин. При наличии плазмоагглютинации такие штаммы считают подозрительными и отвивают на скошенный агар для дальнейшего изучения в коагулазной реакции. При таком отборе число пропускаемых штаммов патогенных стафилококков человеческого происхождения невелико, культуры же, выделенные от животных, требуется проверять в реакции плазмокоагуляции.

Коагулазная проба является основным признаком, определяющим болезнетворность стафилококков, поэтому ее постановка требует к себе максимального внимания. Для выявления коагулазной активности у стафилококков, выделенных от людей, можно пользоваться как цельной кровью, так и плазмой кроликов или человека. Можно использовать также кровь или плазму, взятую непосредственно от человека. Консервированная плазма или кровь, используемые для переливания, непригодны для реакции, так как к ним часто добавляются консерванты, которые препятствуют жизнедеятельности стафилококков, проявлению коагулазной активности. Не следует применять кровь животных или людей, переносящих стафилококковые заболевания, в особенности затяжные, так как она может оказаться нестерильной и содержать антикоагулазу. При работе со стафилококками, выделенными от рогатого скота, можно пользоваться бычьей кровью.

Асептично взятую кровь стабилизируют с помощью 1-4% цитрата или 0,1% оксалата. Для получения плазмы нитратную кровь центрифугируют или отстаивают на холоду. Но, как уже говорилось, можно пользоваться и цельной кровью. Затем кровь разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 3 или 1 : 5 и разливают по 0,2-0,3 мл в стерильные пробирки, которые перед стерилизацией должны быть тщательно вымыты, так как остатки химических веществ могут влиять на результат плазмокоагуляции.

Испытуемые агаровые культуры стафилококков вносят петлей в плазму и хорошо перемешивают. Бульонные культуры вносят пипеткой в объеме 0,1 мл В каждом опыте необходимо ставить контроль с культурами заведомо патогенных стафилококков, дающих коагулазную реакцию, и штаммами коагулазоотрицатель-ных микроорганизмов. Кроме того, часть пробирок с разлитой плазмой следует оставлять не засеянной микробами и выдерживать в термостате на протяжении всего срока опыта. В случае наступления коагуляции хотя бы в одной из них весь опыт нужно переставить с новой порцией крови. Пробирки с исследуемыми культурами выдерживают в термостате при 37 °С в течение суток. Учет результатов проводится обязательно дважды: через 2-3 ч и 24 ч. Учитывают свертывание плазмы и образование сгустков. Обычно культуры, активно продуцирующие коагулазу, дают положительную реакцию уже через 2-3 ч. а если они обладают и выраженной фибринолитической активностью, то первоначально образовавшиеся сгустки могут подвергнуться расплавлению к концу суток. Слабокоагулирующие штаммы могут давать положительную реакцию в поздние сроки-к концу суток. Опыты, давшие сомнительный результат, необходимо повторить.

Некоторые исследователи, получив отрицательный или сомнительный результат, оставляют пробирки на столе. Этого делать нельзя, так как свертывание плазмы в более поздние сроки может носить не специфический характер и его не следует принимать во внимание.

Стафилококки, дающие положительную коагулазную пробу, должны рассматриваться как потенциально патогенные, независимо от наличия или отсутствия у них гемолитических свойств и характера пигмента, их относят к виду St. aureus и в дальнейшем подвергают фаготипизации и проверке на чувствительность к антибиотикам.

Углубленное изучение стафилококков показало, что основной признак па-тогенности - коагулазная реакция может подвергаться изменчивости при воздействии различных факторов (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Падерина, 1966), поэтому в ряде случаев, при выделении коагулазонегативных стафилококков в монокультуре из патологических очагов, целесообразно изучить у них другие признаки потенциальной болезнетворности и прежде всего - способность ферментировать маннит в анаэробных условиях. Известно, что среди коагулазоотрицательных часть культур обладает способностью расщеплять маннит в анаэробных условиях (8,4% -по данным А. А. Акатова и М. Л. Хатеневер, 1974).

Определение ферментации маннита в анаэробных условиях технически очень просто и осуществляется путем посева уколом исследуемых культур в пробирки с высоким столбиком полужидкого агара Хоттннгера, содержащего 1% маннита и 0,004% индикатора бромкрезолпурпура или бромтимолблау (рН == 7,2). Эту среду перед посевом "регенерируют", т. е. кипятят в водяной бане, быстро охлаждают, а после посева заливают слоем стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 5 дней. Однако в значительном числе случаев результаты могут быть учтены уже через сутки.

Наряду с реакцией плазмокоагуляции, большое значение приобрела еще одна важная способность стафилококков, характеризующая их потенциальную патогенность, -дезоксирибонуклеазная активность. Многие исследователи сообщают о высокой корреляции этого признака с коагулазной активностью и токсигенностью изучаемых культур; отмечают, что стафилококки, выделенные из патологического материала, как правило, обладают ДНК-азой. Коагула-зопозитивные штаммы, полученные от носителей, могут не иметь этого фермента, и обычно отсутствие дезоксирибонуклеазной активности сочетается с низкой биохимической способностью и атоксигенностью таких культур стафилококков.

По наблюдениям некоторых исследователей, среди коагулазонегативных штаммов стафилококков, но обладавших другими признаками патогенности, выделенных в ряде случаев от больных с различными гнойными инфекциями, дезоксирибонуклеазную активность проявляли от 10 до 29% таких культур (И. И. Панышева и сотр., 1967; Franklin и соавт., 1966; Lierd и Golde, 1970).

В настоящее время этот тест может служить надежным дифференциальным признаком между патогенными и непатогенными стафилококками и в то же время может помочь в дифференциации степени патогенности коагулазопозитивных штаммов и, безусловно, привлечет внимание к коагулазонегативным, но обладающим этим ферментом культурам стафилококков и в ряде случаев позволит отнести последние к болезнетворным формам с большей уверенностью.

Методика определения дезоксирибонуклеазной активности несложна, в основу ее положен метод Джеффриса. Готовят впрок 2% МПА (рН-8,6), содержащий ДНК (2 мг/мл среды), разливают по флаконам и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин. Перед разливом в чашки к среде добавляют CaCIa (0,8 мг/мл). На подсушенную среду засевают суточные культуры стафилококков. После инкубации в течение 18-20 ч при 37°, на поверхность среды наливают IN раствор НС1 и через 7-10 мин учитывают зоны просветления, которые оценивают крестами (Н. Б. Мордвинова и соавт., 1967).

Нами предложен более экономичный метод для обнаружения ДНК-азы у микроорганизмов. Этот способ, помимо уменьшения в 2 раза расхода ДНК на каждый опыт, позволяет использовать более дешевую низкополимерную нуклеиновую кислоту, изготовляемую Олайнским заводом химических реактивов. Предлагаемая методика широко апробирована на кафедре микробиологии ЛСГМИ и по качеству результатов не уступает общепринятой. Поэтому мы приводим ее подробное описание.

Для приготовления рабочего раствора ДНК, навеску нуклеиновой кислоты из расчета 10 мг/мл помещают в дистиллированную воду, добавляют 0,5 мл 0,2% (или 0,8%) раствора NaOH на каждые 10 мл воды. Для лучшего растворения ДНК смесь либо нагревают до кипения в водяной бане при постоянном перемешивании стеклянной палочкой, либо оставляют на ночь при 37 °С в термостате. К расплавленному и остуженному до 50 °С МПА добавляют рабочий раствор ДНК из расчета 1 мг/мл (на 9 мл МПА-1 мл раствора ДНК), перемешивают, разливают по10л(л в пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или в автоклаве при 0,5 атмосферы в течение 20 мин. Срок хранения- 1-2 мес.

При постановке опыта столбики агара с ДНК растапливают, в водяной бане добавляют 0,1 мл официнального стерильного 10% р-ра СаСЬ, перемешивают и выливают на слой хорошо подсушенного питательного агара в чашки Петри и вновь подсушивают. Суточную агаровую культуру засевают маленькими бляшками (диаметр равен 2-2,5 мм) или штампом-репликатором не более 20-25 бляшек, во избежание слияния зон деполимеризации ДНК. После 18-20-часовой инкубации поверхность агара заливают 5 мл IN раствора НС1 и через 3-5 мин учитывают зоны просветления. Реакции оценивают в крестах.

При этом следует учесть, что интенсивность зоны деполимеризации на плотной среде не всегда совпадает с количеством продукции этого фермента у исследуемых стафилококков в жидких средах.

Для обнаружения фибринолизина используют несколько усовершенствованный метод Кристи с сотр.

Среда Кристи-Чепмена имеет следующий состав: мясной экстракт-0,45 г, пептон-0,75 г, хлористый натрий-1,2 г, агар-2,75 г, вода-130 мл, рН среды == 7,0. Стерилизуется в автоклаве и сохраняется впрок.

Перед опытом среду растапливают, остужают до 50 °С и добавляют 15-20% стерильной цитратной человеческой плазмы. Смесь прогревается в водяной бане при 65-70°С в течение 2- 5 мин до появления ясной мути, а затем разливается в чашки. Испытуемые культуры засевают "пятнами" по 15-20 на чашку. Посевы инкубируют при 37 °С. Учитывается образование зон просветления вокруг колонии первоначально через 14 ч, затем через 24 и 48 ч, так как реакция у различных культур течет неодинаково быстро и у ряда штаммов она развивается в более поздние сроки.

Фибринолитический тест мы считаем весьма пригодным для определения потенциальной болезнетворности стафилококков, но оцениваем только в комплексе с другими признаками активности.

Гиалуронидазная активность определяется по методу Мак-Клина в модификации М. Ш. Могилевского и Л. С. Коган (1949).

Раствор гиалуроната дающий в присутствии 2 N уксусной кислоты типичный сгусток, разливается по 0,5 мл в стерильные пробирки. Добавляется 0,5 мл суточной культуры стафилококка в пептонной воде. Контролями служат: гиалуропат + дистиллированная вода и гиалуропат + незасеянная среда. Смеси встряхиваются и выдерживаются при 37 °С 15-20 мин. Затем в каждую пробирку добавляется по две капли 2 N раствора уксусной кислоты и встряхивается. В контролях должен образоваться слизистый комочек. В опыте при наличии гиалуронидазы он отсутствует, что свидетельствует о деполимеризации гиалуроновой кислоты микробным ферментом.

Для изучения токсигенности стафилококков удобно пользоваться методом, предложенным Илеком и Леви (1950), позволяющим определить типы гемолизинов.

С этой целью готовятся чашки с питательным агаром, содержащим 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека.

На поверхность питательной среды по диаметру помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой. Отступив 1-2 мл от края полоски, перпендикулярно к ней засеивают штрихами исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего учитывают результаты.

Альфа-гемолиз проявляется в виде полного просветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Он выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами

Бета-гемолиз на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление, зона которого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это "тепло-холодовый" токсин и лучше выявляется после дополнительного суточного выдерживания чашек в холодильнике при температуре +4 °С по характерному послойному гемолизу бараньих эритроцитов и не централизуется альфа-антитоксической сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен. Дельта-гемолизин определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Однако образование дельта-гемоли-зина на этих чашках может быть замаскировано действием альфа-токсина и поэтому его следует проверять на средах с эритроцитами человека или лошади. Таким образом, для определения всех 3 типов гемолизинов достаточно использовать эритроциты барана и человека или лошади.

Для определения вирулентности стафилококков существуют несколько различных методов заражения белых мышей.

Наиболее простым является введение 0,1 мл суточной бульонной культуры испытуемого стафилококка в хвостовую вену. Учет гибели животных осуществляется в течение 10 суток, регистрируют наличие абсцессов в почках.

Удобно пользоваться способом Badenski и сотр. (1958), Суточная бульонная культура центрифугируется при 3000 об/мин - 30 мин. Полученный осадок ресуспендируется в половинном объеме декантата и в количестве 0,05 мл вводится 6 мышам позади глазного яблока в окологлазничную клетчатку. Культуру, вызывающую гибель половины и более зараженных мышей в течение 6 дней, считают вирулентной.

При этих методах заражения вирулентной культурой у животных развивается общин септический процесс с преимущественным поражением почек. Основная гибель мышеи происходит на 3-5-й день после заражения.

Другие способы заражения белых мышей (внутрибрюшинный и интраназальный) требуют в десятки

раз большей заражающей дозы, максимум гибели мышей приходится на 1-2-е сутки, что характеризует преимущественно токсический компонент процесса (С. А. Анатолий, И. И. Антоновская, 1967).

В то же время ряд исследователей отдают предпочтение более простому технически внутрибрюшинному способу заражения мышей, который одновременно позволяет изучать клеточные и гуморальные механизмы развития инфекции.

Сопоставление вирулентности стафилококков для белых мышей с отдельными факторами их патогенности показало, что вирулентность штаммов, по данным большого числа исследователей, коррелирует с уровнем альфа-гемотоксина. Что касается других признаков патогенности и их корреляции с вирулентностью, то получены разноречивые сведения. Так, по данным С. А. Анатолия (1969), вирулентность штаммов коррелировала с продукцией бета-гемолизина, летального фактора, лецитовителлазы, гиалуронидазы и коагулазы. А. К. Акатов (1968) не отмечает корреляции вирулентности с коагулазной, лециговител-лазной, фибринолитической активностью, не установлена корреляция с дельта-токсигенностью.

Для сравнения вирулентности стафилококковых культур можно использовать их способность вызывать дермонекротическую реакцию у кроликов.

Готовят 4-миллиардную взвесь суточной агаровой культуры стафилококка в физиологическом растворе, а из полученной густоты делают разведения, чтобы получить 2- и 1-миллиардные взвеси. Из каждого разведения в объеме 0,1 мл, что составляет 100, 200, 400 миллионов микробных тел, вводят кролику в выстриженную или депилированную накануне кожу. На одном кролике можно одновременно поставить до 8 внутрикожных проб. Ежедневно отмечают проявления дермонекротической реакции, а окончательно на 4-е сутки. За минимальную дермонекротическую дозу принимают то наименьшее количество культуры, которое дает некроз на 4-е сутки (Г. В. Выгодчиков, 1963).

Список использованной литературы

А.М.Смирнова, А.А.Трояшкин, Е.М.Падерина: микробиология и профилактика стафилококковых инфекций - "Медицина", 1977.

Стафилококковые инфекции: российский сб. науч. тр. - С.-П., 1991.

А.М.Смирнова: вопросы иммунологии и микробиологии стафилококковых и стрептококковых инфекций - Ленинград, 1975.

Лекция по теме.

Методическая разработка кафедры.